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细胞培养常见问题及解答

2018-03-22

 1. 如何选用特殊细胞系培养基?


 培养某一类型细胞没有固定的培养条件。在MEM中培养的细胞,很可能在DMEM或M199中同样很容易生长。总之,**MEM做粘附细胞培养、RPMI-1640做悬浮细胞培养是一个好的开始。




2. 何时须更换培养基?


视细胞生长密度而定,或遵照细胞株基本数据上的更换时间,按时更换培养基即可。


 



3. 可否使用与原先培养条件不同的培养基?  


不能。每一细胞株均有其特定使用且已适应的细胞培养基,若骤然使用和原先提供的培养条件不同的培养基,细胞大都无法立即适应,造成细胞无法存活。


 



4. 可否使用与原先培养条件不同的血清种类?

不能。血清是细胞培养上一个极为重要的营养来源,所以血清的种类和品质对于细胞的生长会产生极大的影响。来自不同物种的血清,,在一些物质或分子的量或内容物上都有所不同,血清使用错误常会造成细胞无法存活。


 



5. 何谓FBS, FCS, CS, HS ?

FBS (fetal bovine serum) 和FCS (fetal calf serum) 是相同的意思,两者都是指胎牛血清,乃错误的使用字眼,请不要再使用。CS (calf serum) 则是指小牛血清。HS (horseserum) 则是指马血清。


 



6. 培养细胞时应使用5% 或10% CO2?或根本没有影响?

一般培养基中大都使用HCO3-/CO3 2-/H+ 作为pH 的缓冲系统,而培养基中NaHCO3 的含量将决定细胞培养时应使用的CO2 浓度。当培养基中NaHCO3 含量为每公升3.7 g 时,细胞培养时应使用10% CO2;当培养基中NaHCO3 为每公升1.5 g 时,则应使用5% CO2 培养细胞。


 



7.Hank's 平衡盐溶液(HBS)要在空气中使用,不需要CO2培养箱。原因是什么?Hank's 平衡盐溶液(HBS)和Earle's平衡盐溶液(EBS)有什么本质的功能差别?

HBS和EBS 的主要差别在于碳酸氢钠的水平,在Eagles (2.2 g/L)中比在Hanks (0.35 g/L) 中高。碳酸氢钠需用高水平的CO2平衡,以维持溶液的PH值。Eagles液在空气水平的CO2 中,溶液会变碱,Hanks液在CO2培养箱中会变酸。如果希望在CO2培养箱中保存组织,需要用Eagles液,如果仅仅是清洗将要在细胞培养基中储存的组织,用Hanks液就可以了。


 



8. 什么是细胞的接种密度?

依照细胞株基本数据上的接种密度或稀释分盘的比例接种即可。细胞数太少或稀释的太多亦是造成细胞无法生长之一重要原因。


 



9. 悬浮性细胞应如何继代处理?

一般仅需持续加入新鲜培养基于原培养角瓶中,稀释细胞浓度即可,若培养液太多时,可将培养角瓶口端稍微抬高,直到无法容纳为止。分瓶时取出一部份含细胞的培养液至另一新的培养角瓶,加入新鲜培养基稀释至适当浓度,重复前述步骤即可。


 



10. 冷冻管应如何解冻? 

取出冷冻管后,须立即放入37℃水槽中快速解冻,轻摇冷冻管使其在1 分钟内全部融化,并注意水面不可超过冷冻管盖沿,否则易发生污染情形。另冷冻管由液氮桶中取出解冻时,必须注意安全,预防冷冻管之爆裂。


 



11. 细胞冷冻管解冻培养时, 是否应马上去除DMSO?

除少数特别注明对DMSO 敏感的细胞外,绝大部分细胞株(包括悬浮性细胞),在解冻之后,应直接放入含有10-15 ml新鲜培养基的培养角瓶中,待隔天再置换新鲜培养基以去除DMSO 即可,如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附的问题。


 



12. 附着性细胞继代时所使用的trypsin-EDTA 浓度?应如何处理?

一般使用的trypsin-EDTA 浓度为0.05% trypsin-0.53 mM EDTA Na4。 第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中,保存于-20 ℃,避免反复冷冻解冻造成trypsin 的活性降低,并可减少污染的机会。


 



13. 欲将一般动物细胞离心下来,其离心速率应为多少转速?

回收动物细胞,其离心速率一般为300xg (约1 000 rpm),5-10 分钟,过高的转速,将造成细胞死亡。


 



14. 细胞冷冻培养基的成份为何?

动物细胞冷冻保存时*常使用的冷冻培养基是含5-10% DMSO (dimethyl sulfoxide) 和90-95% 原来细胞生长用的新鲜培养基均匀混合之。注意:由于DMSO 稀释时会放出大量热能,故不可将DMSO 直接加入细胞液中,必须使用前先行配制完成。


 



15. DMSO 的等级和无菌过滤的方式为何?

冷冻保存使用的DMSO 等级,必须为Tissue culture grade之DMSO (如Sigma D2650),其本身即为无菌状况,第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中,保存于4℃,避免反复冷冻解冻造成DMSO 的裂解而释出有害物质,并可减少污染的机会。若要过滤DMSO,则须使用耐DMSO 的Nylon 材质滤膜。


 



16. 冷冻保存细胞的方法?

冷冻保存方法一:冷冻管置于4℃ 30~60 分钟→ (-20℃ 30 分钟*) → -80℃16~18 小时(或隔夜) → 液氮槽vaporphase 长期储存。


冷冻保存方法二:冷冻管置于已设定程序的可程序降温机中每分钟降1-3 ℃至-80℃以下,再放入液氮槽vapor phase长期储存。*-20℃不可超过1 小时,以防止冰晶过大,造成细胞大量死亡,亦可跳过此步骤,接放入-80℃冰箱中,惟存活率稍微 降低一些。


 



17. 细胞欲冷冻保存时, 细胞冷冻管内应有多少细胞浓度?

冷冻管内细胞数目一般为1x106 cells/ml vial,融合瘤细胞则以5x106 cells/ml vial 为宜。 


 



18.培养基中是否须添加抗生素? 

除于特殊筛选系统中外,一般正常培养状态下,培养基中不应添加任何抗生素。


 



19. 应如何避免细胞污染?

细胞污染的种类可分成细菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉浆菌。主要的污染原因为无菌操作技术不当、操作室环境不佳、污染的血清和污染的细胞等。严格的无菌操作技术、清洁的环境、与品质良好的细胞来源和培养基配制是减低污染的**方法。当然,适当添加抗生素也是防止细胞污染的途径,Invivogen公司就能提供多种细胞抗生素类产品:


 



Primocin™——原代细胞抗生素

 Primocin™是专门设计用于保护原代细胞免受微生物污染的抗生素,对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、支原体和真菌均有杀伤作用。Primocin™对原代细胞没有毒性,因为其作用的靶标只存在于微生物上。其中细菌的靶标为DNA解旋酶和原核细胞核糖体亚基30S和50S;真菌的靶标为麦角固醇(一种只发现于真菌和酵母细胞膜的分子)。Primocin™的推荐使用浓度为100 mg/ml,无需添加青霉素/链霉素。


 产品名称

 规格

 产品编号

 Primocin™

 500 mg (10 x 1 ml)

 ant-pm-1

 1 g (1 x 20 ml)

 ant-pm-2


Normocin™——细菌、真菌、支原体多效抗生素

Normocin™具有抗细菌、真菌、支原体三种微生物的作用,其包含两种成分可通过阻断DNA复制和蛋白合成来杀灭细菌和支原体。第三种成分通过干扰细胞膜离子交换来清除酵母和真菌。Normocin™推荐使用浓度为100 mg/ml,该浓度对细胞没有毒性。此外,如果与青霉素/链霉素合用,可以增加抗菌谱。


 产品名称

 规格

 产品编号

  Normocin™

 500 mg (10 x 1 ml)

 ant-nr-1

 1 g (1 x 20 ml) ant-nr-2


Fungin™——真菌特异性抗生素

Fungin™是Pimaricin(匹马菌素)的可溶性形式,Pimaricin是十九世纪五十年代发现的多烯抗真菌试剂,可通过干扰细胞膜离子交换的方式杀灭酵母、霉菌和真菌。Fungin™十分稳定,在37°C放置6天仍具有活性。与Amphotericin B(两性霉素B)需要溶于有毒的脱氧胆酸盐不同,Fungin™是水溶性的,对细胞无毒性,并且不会影响细胞代谢,推荐使用浓度为10 mg/ml - 50 mg/ml。 


 产品名称

 规格

 产品编号

 Fungin™ 

 75 mg (5 x 1.5 ml)

 ant-fn-1

 200 mg (1 x 20 ml) ant-fn-2



20. 如果细胞发生微生物污染时,应如何处理?

原则上:直接灭菌后丢弃之。


当重要的培养污染时,研究者可能试图消除或控制污染。首先,确定污染物是细菌、真菌、支原体或酵母,把污染细胞与其它细胞系隔离开,用实验室消毒剂消毒培养器皿和超净台,检查HEPA过滤器。


高浓度的抗生素和抗霉菌素可能对一些细胞系有毒性,因而,做剂量反应实验确定抗生素和抗霉菌素产生毒性的剂量水平。这点在使用抗生素如两性霉素B和抗霉菌素如泰乐菌素时尤其重要。下面是推荐的确定毒性水平和消除培养污染的实验步骤。


(1)  在无抗生素的培养基中消化、计数和稀释细胞,稀释到常规细胞传代的浓度。


(2)  分散细胞悬液到多孔培养板中,或几个小培养瓶中。在一个浓度梯度范围内,把选择抗生素加入到每一个孔中。例如,两性霉素B推荐下列浓度,0.25,0.50,1.0,2.0,4.0,8.0 mg/ml。


(3)  每天观测细胞毒性指标,如脱落,出现空泡,汇合度下降和变圆。


(4)  确定抗生素毒性水平后,使用低于毒性浓度2~3倍浓度的抗生素的培养液培养细胞2~3代。


(5)  在无抗生素的培养基中培养细胞一代。


(6)  重复步骤4。


(7)  在无抗生素的培养基中培养4~6代,确定污染是否以已被消除。


 



21. 支原体(mycoplasma) 污染的细胞, 是否能以肉眼观察出异状?

不能。除极有经验之专家外,大多数遭受支原体污染的细胞株,无法以其外观分辨之。


 



22. 支原体污染会对细胞培养有何影响?

支原体污染几乎可影响所有细胞的生长参数,代谢及研究的任一数据。故进行实验前,必须确认细胞为mycoplasma-free,实验结果的数据方有意义。


 



23. 侦测出细胞株有支原体污染时, 该如何处理?

直接灭菌后丢弃,以避免污染其它细胞株,但是如果您的样本珍贵,建议您使用支原体去除试剂去除污染


 


Plasmocin™——支原体预防与去除利器

Plasmocin™是目前全球*受科研工作者欢迎的支原体抗生素之一。其包含大环内酯物及对苯二酚两种主要成分,可有效作用于支原体复制的蛋白合成阶段和DNA复制阶段,只需两周即可清除支原体污染,并且不会影响细胞本身代谢;其特有的转运载体可以将有效成分转运到细胞内,故对胞内支原体和胞外游离的支原体都十分有效。此外,低浓度的Plasmocin™对多种革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌也有一定的清除作用。

 

Plasmocin™ Treatment (ant-mpt)

用于清除支原体污染,使用浓度为25 ug/ml,2周即可彻底清除支原体。

Plasmocin™ Prophylactic (ant-mpp)

用于预防支原体污染,定期添加于细胞培养基中,使用浓度为2.5 - 5 ug/ml。


 产品名称

 规格

 产品编号

 Plasmocin™ treatment

 50 mg (2 x 1 ml)

 ant-mpt

 Plasmocin™ prophylactic

 25 mg (10 x 1 ml)

 ant-mpp


Plasmocure™——强力清除具有Plasmocin™抗性的支原体

据报道在极少数情况下,有些支原体对Plasmocin™ 具有抗性。基于此,InvivoGen又开发了第二款支原体抗生素Plasmocure™。Plasmocure™采用不同于Plasmocin™作用机制的两种抗生素来杀灭支原体,处理两周时间即可彻底清除这些顽固支原体。在处理过程中有轻度的细胞毒性,但支原体清除后细胞系可完全恢复。Plasmocure™推荐使用浓度为50 mg/ml。


 产品名称

 规格

 产品编号

 Plasmocure™

 100 mg (1 x 1 ml)

 ant-pc




24. CO2 培养箱的水盘如何保持清洁?

定期(至少每两周一次) 以无菌蒸馏水或无菌去离子水更换之。


 



25. 为何培养基保存于4℃ 冰箱中, 颜色会偏暗红色,且pH值会越来越偏碱性?

培养基保存于4℃冰箱中,培养基内的CO2会逐渐溢出,造成培养基越来越偏碱性。而培养基中的酸碱指示剂(通常为phenol red) 的颜色也会随碱性增加而更偏暗红。培养基偏碱的结果,将造成细胞生长停滞或死亡。若培养基偏碱时,可以通入无菌过滤的CO2, 以调整pH 值。


 



26. 各种细胞培养用的dish,flask是否均相同?

不同厂牌的dish 或flask,其所coating 的polymer 不同,制造程序亦不同,虽对大部分细胞没有太大之影响,惟少数细胞则可能因使用厂牌不同的dish 或flask 而有显著的生长差异。


 



27. 购买的细胞冷冻管经解冻后,为何会发生细胞数目太少的情形?

研究人员在冷冻细胞的培养时出现细胞数目太少,大都是因为离心过程操作上的失误,造成细胞的物理性损伤,以及细胞流失。建议细胞解冻后不要立刻离心,应待细胞生长隔夜后再更换培养基即可。


 



28. 购买的细胞死亡或细胞存活率不佳可能原因?

研究人员在细胞培养时出现存活率不佳,常见原因可归纳为:培养基使用错误或培养基品质不佳。血清使用错误或血清的品质不佳。解冻过程错误。冷冻细胞解冻后,加以洗涤细胞和离心。悬浮细胞误认为死细胞。培养温度使用错误。细胞置于-80℃太久。


 



29. 如何避免沉淀物的产生?

我们建议您在使用血清的时候,注意下列的操作:


(1)  解冻血清时,请按照所建议的逐步解冻法(-20℃至4℃至室温),若血清解冻时改变的温度太大(如-20℃至37℃),非常容易产生沉淀物。


(2)  解冻血清时,请随时将之摇晃均匀,使温度及成分均一,减少沉淀的发生。


(3)  请勿将血清置于37℃太久。若在37℃放置太久,血清会变得混浊,同时血清中许多较不稳定的成分也会因此受到损害,而影响血清的质量。


(4)  血清的热灭活非常容易造成沉淀物的增多,若非必要,可以无须做此步骤。


(5)  若必须做血清的热灭活,请遵守56℃,30分钟的原则,并且随时摇晃均匀。温度过高,时间过久或摇晃不均匀,都会造成沉淀物的增多。


 



30.  L-谷氨酰胺在细胞培养中重要吗?它在溶液中不稳定吗?

L-谷氨酰胺在细胞培养时是重要的。脱掉氨基后,L-谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源、参与蛋白质的合成和核酸代谢。L-谷氨酰胺在溶液中经过一段时间后会降解,但是确切的降解率一直没有*终定论。L-谷氨酰胺的降解导致氨的形成,而氨对于一些细胞具有毒性。


 



31.  GlutaMAX-I是什么?培养细胞如何利用GlutaMAX-I?这个二肽有多稳定?

GlutaMAX-I 二肽是一个L-谷氨酰胺的衍生物,其不稳定的alpha-氨基用L-丙氨酸来保护。一种肽酶逐渐裂解二肽,释放L-谷氨酰胺供利用。


GlutaMAX-I二肽非常稳定,即使在121℃灭菌20分钟,GlutaMAX-I 二肽溶液有*小的降解,如果在相同条件下,L-谷氨酰胺几乎完全降解。


 



32. 什么培养基中可以省去加酚红?

酚红在培养基中用作PH值的指示剂:中性时为红色,酸性时为黄色,碱性时为紫色。研究表明,酚红可以模拟固醇类激素的作用,(特别是雌激素)。为避免固醇类反应,培养细胞,尤其是哺乳类细胞时,不用加。



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