​大鼠（Rat）25羟基维生素D（25-OH-VD）ELISA检测试剂盒

大鼠（Rat）25羟基维生素D（25-OH-VD）ELISA检测试剂盒

产品货号：DM-F134

产品规格：48/96T

ELISA 试剂盒，全称酶联免疫吸附试验试剂盒（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay Kit），是基于抗原 - 抗体的特异性免疫结合特性，搭配酶促信号放大体系，实现对生物样本中目标物质精准定性、＊＊定量的商品化成套实验试剂。它是生命科学、生物医药领域最主流的蛋白类物质定量工具，也是你此前检测细胞培养上清中目标因子、验证样本冻存合规性的核心实验载体。

酶标检测抗体：针对目标物另一结合表位的特异性抗体，提前偶联了辣根过氧化物酶（HRP，最常用）或碱性磷酸酶（AP），可与捕获抗体、目标物形成稳定的 “夹心复合物”，通过偶联酶的催化作用实现信号放大，让微量目标物也能被检测到。

底物液：最常用的是 TMB 底物，可与 HRP 发生酶促反应产生蓝色显色产物，显色的深浅与样本中目标物的浓度呈严格正相关，是定量检测的信号来源。 

终止液：多为稀硫酸溶液，可瞬间终止酶促显色反应，让蓝色产物转为稳定的黄色，终止后需在 10 分钟内用酶标仪读取特定波长下的吸光度值（OD 值），完成信号检测。 

浓缩洗涤液：多为含吐温的 PBST 缓冲液，用于孵育后洗去孔内未结合的游离物质，降低非特异性结合带来的背景干扰，是保证检测结果准确性的核心组分，也是你此前关注的「洗板操作一致性」的核心物料。 

样本 / 标准品稀释液：用于梯度稀释标准品和待测样本，可消除细胞培养基、血清等带来的基质效应，保证所有样本的反应体系完全一致，避免检测结果失真。 

封板膜：孵育时用于密封酶标板，避免孔内液体蒸发、外源污染，保证板内所有孔的孵育环境完全均一。 

你检测细胞培养上清中蛋白类目标物，使用的几乎都是双抗体夹心 ELISA 试剂盒，这也是目前最主流的试剂盒类型，核心工作原理如下：

捕获阶段：将标准品、待测样本加入预包被了捕获抗体的酶标板孔中孵育，样本中的目标物会被捕获抗体特异性抓取，固定在孔底； 

洗涤去除杂质：洗去未结合的游离蛋白、培养基杂质等非特异性物质，仅保留结合在孔底的目标物； 

检测与信号放大：加入酶标检测抗体，与目标物的另一表位结合，形成 “捕获抗体 - 目标物 - 酶标检测抗体” 的夹心复合物，再次洗涤去除未结合的多余抗体； 

显色与读数：加入底物液，复合物上偶联的酶会催化底物显色，加入终止液终止反应后，用酶标仪读取 OD 值；最终通过标准品的浓度和对应 OD 值拟合标准曲线，即可换算出待测样本中目标物的精准浓度。 

根据检测目标物和反应模式，ELISA 试剂盒主要分为两类，你日常使用的以＊＊类为主：

双抗体夹心 ELISA 试剂盒：适用于检测细胞因子、抗体、重组蛋白等大分子物质，也是细胞培养上清样本检测的金标准方案，特异性强、灵敏度高、可精准定量； 

竞争法 ELISA 试剂盒：适用于检测激素、小分子多肽等分子量过小、无法同时结合两个抗体的物质，通过竞争结合的模式实现定量。 

ELISA 试剂盒之所以成为你这类细胞实验样本检测的＊＊工具，核心优势在于：灵敏度极高，通过酶促信号放大可检测到 pg/mL 级别的微量目标物，完全适配细胞培养上清中低丰度细胞因子的检测；特异性极强，基于抗原 - 抗体的特异性结合，可精准识别目标物，几乎不受样本中其他蛋白的干扰；操作简便、通量高，预制体系无需自行优化，可同时检测数十个样本，适配批量细胞孔样本的检测需求；可实现＊＊定量，通过标准品可精准换算出样本中目标物的具体浓度，而非仅定性判断阴阳，完全匹配你验证样本浓度是否符合冻存要求、合并后样本均一性的实验需求。

ELISA（酶联免疫吸附测定，Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）的核心原理是：抗原与抗体的特异性免疫反应 + 酶催化底物的化学显色反应，通过颜色深浅定量 / 定性判断样本中待测物浓度。

一、核心逻辑（所有 ELISA 都遵循）

1. 免疫识别：利用抗原（Ag）和抗体（Ab）之间高度特异性结合，只 “抓” 目标分子。

2. 酶标记放大：将酶（常用 HRP、AP）标记在抗体 / 抗原上，作为信号放大系统。

3. 底物显色：酶催化无色底物生成有色产物，颜色深浅与酶量成正比，也与待测物浓度成正比。

4. 比色定量：酶标仪测吸光度（OD 值），通过标准曲线计算待测物浓度。

二、四大经典 ELISA 检测原理（最常用）

1. 双抗体夹心法（Sandwich ELISA）—— 最常用，测大分子抗原 / 蛋白

适用对象：大分子蛋白、细胞因子、激素、膜蛋白、分泌蛋白等（有多个抗原表位）。结构：捕获抗体 → 待测抗原 → 检测抗体（酶标 / 生物素化）。

步骤逻辑：

1. 固相载体（微孔板）预包被捕获抗体（Capture Ab）。

2. 加入样本，样本中的待测抗原（Ag）与捕获抗体特异性结合。

3. 加入酶标记检测抗体（Detection Ab-HRP），与抗原另一表位结合，形成：捕获 Ab - 抗原 Ag - 检测 Ab-HRP 夹心复合物。

4. 洗去未结合物质，加入底物 TMB，HRP 催化显色。

5. 加终止液，测 OD 值。颜色越深 → 抗原浓度越高。

特点：

特异性高、灵敏度高（pg/mL 级）。

适合大分子、多表位抗原。

不适合小分子（如激素、药物小分子，表位太少夹不住）。

2. 直接法 ELISA（Direct ELISA）—— 最简单，测抗原

适用对象：已知抗原定性 / 半定量，或包被抗原的验证。结构：固相抗原 → 酶标一抗。

步骤逻辑：

1. 微孔板直接包被待测抗原（Ag）。

2. 加入酶标记一抗（Primary Ab-HRP），直接与抗原结合。

3. 洗板、加底物显色、测 OD。

4. 颜色越深 → 抗原量越多。

特点：

步骤最少、速度快。

但灵敏度低，一抗需酶标记，通用性差。

科研中多用于包被效率验证，少用于临床 / 精确定量。

3. 间接法 ELISA（Indirect ELISA）—— 主要测抗体（如抗体滴度、自身抗体）

适用对象：检测样本中的抗体（如 IgG、IgM、病毒抗体、自身抗体）。结构：固相抗原 → 一抗（样本抗体） → 酶标二抗。

步骤逻辑：

1. 微孔板包被已知纯化抗原（Ag）。

2. 加入样本，样本中的 ** 待测抗体（Ab）** 与抗原结合。

3. 加入酶标记二抗（Secondary Ab-HRP，抗人 / 抗鼠 IgG 等），识别一抗 Fc 段。

4. 洗板、显色、测 OD。颜色越深 → 样本中抗体滴度越高。

特点：

灵敏度高，二抗可通用（同一酶标二抗可测多种一抗）。

主要用于抗体检测，不适合测抗原。

4. 竞争法 ELISA（Competitive ELISA）—— 测小分子抗原 / 半抗原

适用对象：小分子激素、药物、多肽、毒素、小分子代谢物（只有一个表位，无法夹心）。结构：固相抗体 / 抗原 + 酶标抗原 / 抗体与样本待测物 “竞争结合”。

有两种常见形式，原理一致、方向相反：

（1）抗体包被，酶标抗原竞争（最常用）

1. 微孔板包被捕获抗体。

2. 同时加入：样本待测小分子抗原 + 酶标记抗原（Ag-HRP）。

3. 两者竞争结合有限的抗体位点：

4. 样本中抗原多 → 占据更多抗体 → 酶标抗原结合少 → 显色浅。

5. 样本中抗原少 → 酶标抗原结合多 → 显色深。

6. 显色后，OD 值与待测抗原浓度成反比。

（2）抗原包被，酶标抗体竞争

1. 微孔板包被已知抗原。

2. 样本待测抗原 + 酶标抗体混合加入，竞争结合抗原。

3. 样本抗原多 → 酶标抗体结合少 → 显色浅。

特点：

必须用于小分子、单表位物质。

标准曲线是下降型（浓度越高，OD 越低），计算时注意方向。

特异性要求极高，否则易受结构类似物干扰。

三、信号系统原理（HRP + TMB 最常见）

绝大多数 ELISA 用这套：

1.酶：辣根过氧化物酶（HRP）。

2.底物：TMB（四甲基联苯胺），无色。

3.反应：HRP 催化 H₂O₂氧化 TMB → 生成蓝色可溶性产物。

4.终止：加硫酸（终止液），蓝色变为黄色，稳定。

5.读数：450 nm 测 OD（参考波长 630 nm）。

一句话总结

双抗体夹心法：捕获抗体抓抗原，酶标抗体再夹心，色深 = 浓度高。

间接法：抗原抓样本抗体，酶标二抗放大，色深 = 抗体高。

竞争法：样本与酶标物抢结合位点，色浅 = 浓度高。

试剂盒的组成

结果判断

一、显色与 OD 值初判（肉眼 + 酶标仪）

显色观察：标准品孔应呈梯度显色（TMB 底物终止后由蓝变黄）；空白 / 阴性对照基本无色。 

OD 值质控（夹心法常用）：空白孔 OD ＜ 0.2 

＊＊标准品 OD ＞ 1.0 

样本 OD 需落在标准曲线范围内；超出上限→稀释重测；低于下限→浓缩或换高敏试剂盒 

二、标准曲线与对照验证（实验有效性）

标准曲线：相关系数 R² ≥ 0.99（越接近 1 越好） 

推荐用 四参数逻辑（4PL）拟合 

标准品 CV% ＜ 8% 

对照孔：阴性对照（NC）：背景低，过高提示非特异结合 

阳性对照（PC）：应有明显信号，无信号则实验失败 

样本重复性：复孔 CV% ＜ 10%（可靠）；10%–15% 可接受；＞15% 需重测 

三、结果判读方法

1. 定性判断（阴 / 阳）

计算 Cut-off 值（按试剂盒说明书，常见：NC 均值 + 2SD 或 NC×2.1） 

样本 OD ＞ Cut-off → 阳性 

样本 OD ＜ Cut-off → 阴性 

接近 Cut-off → 复测确认 

2. 定量判断（浓度计算）

用标准曲线将样本 OD 值换算为目标物浓度 

结果需在试剂盒检测范围内 

3. 半定量判断（效价 / 相对水平）

以＊＊稀释倍数仍呈阳性为效价，用于抗体滴度等 

四、常见异常与处理

高背景 / 花板：优化封闭、洗涤，降低抗体浓度 

无显色 / 显色过浅：检查底物、抗体活性，延长孵育 

曲线 R² 低 / 点偏离：排查移液、标准品稀释、孵育条件 

复孔 CV 大：规范加样、洗板，减少边缘效应