三甲基尿酸的ELISA定量检测试剂盒

三甲基尿酸的ELISA定量检测试剂盒

（酶联免疫法）

用于体外定量检测血清等样本中三甲基尿酸的含量

线性范围：0.78-50 μmoL/L

预期用途

本试剂盒设计用于定量检测血清、血浆、组织匀浆提取液等样本中的三甲基尿酸浓度，仅供研究使用，不得用于医学诊断。

检测原理

试剂盒采用竞争法原理：将合成半抗原包被于酶标板上，同时加入样品和抗体试剂（一抗），样品中的待测物与半抗原上偶联的待测物竞争结合抗体（一抗），结合形成“半抗原-抗体”免疫复合物，清洗取出游离的免疫复合物后，加入TMB显色后，样本中待测物浓度越高蓝色越浅，加入终止液，用酶标仪在450 nm处测OD值，颜色的深浅和样品中的待测物含量呈反比，通过绘制标准曲线计算出样本中待测物的浓度。

包含的实验材料实验材料

如需单独采购通用型组分，请提供对应的组分名称。

需要但未包含的实验材料

• 蒸馏水或去离子水，一次性离心管、一次性手套等耗材；

• 移液器、多通道移液器及配套枪头；

• 烧杯、量筒、试剂瓶等容器具；

• 用于封贴微孔板的封板膜或其他替代材料；

• 微孔板振荡器（如有需要）、离心机、旋涡振荡器等辅助设备；

• 恒温培养箱、恒温水浴箱、酶标仪、洗板机。

试剂的准备及储存

• 试剂盒各组分应储存于2~8℃保存；

• 使用前请确保试剂盒按规定的条件储存，每次实验仅准备所需实验用量的试剂，试剂盒最多可以使用3次；

• 校准品（10×）开封前应离心30秒，确保所有校准品集中于底部；

• 1×洗液的配制：浓缩洗液（20×）如有晶体析出，需在37℃下加热至晶体全部溶解后使用。用蒸馏水1:20稀释，例如：10mL浓缩洗涤液加入190mL的蒸馏水，混合均匀。配制好的洗液可以在2~8℃保存1周；

• 校准品的配制：准备7个试管，先将10×校准品（500μmoL/L）按需吸取一定量用通用稀释液稀释10倍配制成检测线性范围上限校准品S1（50μmoL/L）。（例：50uL的校准品（10×）+450uL的通用稀释液，制备得到500μL的S1浓度校准品）。随后在6个离心管中分别加入250μL的通用稀释液，在这6个试管（S2~S7）中将S1校准品依次倍比稀释6个梯度至S7，共配制7个浓度的校准品，依次为：S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7，如下图所示，通用稀释液作为零浓度校准品S0。
  

• 一抗抗体工作的配制：一抗抗体（10×）使用通用稀释液按1:10倍稀释，例如：100uL一抗抗体加入900uL的通用稀释液。配制好的一抗抗体工作液可保存8小时。
  样品采集、预处理及储存
  下面列出的样品收集和储存条件旨在作为一般性指导，不同类型样品的储存、使用稳定性尚未完全评估。

• 血清：使用血清采集管采集全血，室温静置待血细胞凝集后取的血清，或直接在1000×g下离心15分钟取得血清。操作应柔和，避免溶血发生。获取的血清应及时进行检测，如不能及时进行检测，应等分为多份，储存在-20℃及以下温度条件，储存时间不超过6个月，冷冻储存血清样品冻融不超过2次。血清样品建议2倍以上稀释，例如：50μL样品+50μL的1×通用样品稀释液，稀释后的血清样本可在2~8℃储存不超过8小时。应选取1~2份样本进行预实验确定＊＊稀释度。

• 血浆：使用EDTA或肝素采血管收集血浆。全血采集后以1000×g离心15分钟取得血浆。操作应柔和，避免溶血发生。获取的血浆应及时进行检测，如不能及时进行检测，应等分为多份，储存在-20℃及以下温度条件，储存时间不超过6个月，冷冻储存血浆样品冻融不超过2次。血浆样品建议2倍以上稀释，例如：50μL样品+50μL的1×通用样品稀释液，稀释后的血清样本可在2~8℃储存不超过8小时。应选取1~2份样本进行预实验确定＊＊稀释度。

• 组织匀浆：用预冷的PBS（0.01M，pH=7.4）冲洗组织，去除残留血液（匀浆中裂解的红细胞会影响检测结果），称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS（一般按1:9的重量体积比，比如1g的组织样品对应9mL的PBS，具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录。推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂）加入玻璃匀浆器中，于冰上充分研磨或匀浆机研磨。为了进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行超声破碎，或反复冻融。最后将匀浆液于5000×g离心5-10分钟，取上清检测。
  实验步骤
  使用前将所有试剂置于室温平衡30分钟左右，也可置于37℃温箱快速回温至室温。
  注意：酶标板未恢复室温前，请勿开封。

  1	每孔加入50μL校准品S0-S7以及预处理过的待测样品。
  2	每孔加入50μL预先稀释好的一抗抗体工作液，混匀
  3	盖上封板膜，在37℃下孵育60分钟。
  4	洗板5次，最后一次洗板后弃去残留洗液，倒扣酶标板，在干净的吸水纸上拍干。
  5	每孔加入100μL酶标二抗（红色液体试剂）
  6	37℃孵育30**分钟。
  7	洗板5次，最后一次洗板后弃去残留洗液，倒扣酶标板，在干净的吸水纸上拍干。
  8	每孔加入100μL显色液。
  9	37℃下避光孵育15**分钟。
  10	每孔加入50μL终止液。
  11	使用酶标仪在450nm检测波长及620~690nm参比波长条件下测定吸光度值，如果没有参比波长则仅选择450nm波长进行检测。如果＊＊浓度校准品OD值过高，应立即在405/630nm双波长条件下检测。

  * 建议微孔板振荡器振幅选择500~550RPM转速。
  ** 孵育时间可结合显色程度适当增减，建议孵育中途适当观察显色强度。

• 结果计算

双波长检测结果无需进行调，直接进行标曲拟合及结果计算。

单波长检测结果建议使用0浓度校准品OD值调0后进行标曲拟合及结果计算。

建议使用以下方式进行标准曲线的拟合：

• 四参数逻辑（4-P）曲线拟合：建议以浓度值为横坐标（舍弃0浓度点），吸光度值为纵坐标；

• Logit-Log拟合：推荐使用软件；

建议使用专业化软件进行结果拟合和计算，如ELISACALC、SPSS、Graphpad Prism等。示例数据

以下数据和曲线仅供参考，实验者需根据自己的实验数据建立标准曲线。

校准品浓度 (μmoL/L)	OD450/630值
50.0	0.120
25.0	0.188
12.5	0.284
6.25	0.498
3.13	0.822
1.56	1.100
0.78	1.602
0.00	2.350

检测的局限性

样本浓度超出检测范围上限时，应当进行适当加大稀释倍数后再次检测，计算结果应当乘上稀释倍数。

样本浓度低于LOQ定量限时，检测结果无法进行准确定量。

＊＊结果上限为：＊＊浓度校准品×样本稀释倍数。

＊＊结果下限为：LoQ×样本稀释倍数

LoQ 见产品性能指标章节

产品性能指标

准确度——精密度（Accuracy-Precision）

重复性（Intra-Assay）（操作内，n=20）

操作内精密度（测定中的精密度）在固定的条件下（相同操作者、相同仪器、相同试剂批次、单日内）使用3个血清样本分别检测20次进行评价，CV＜15%。

再现性（Inter-Assay）（操作间，n=60）

再现性（测定间的精密度）在不同的条件下（不同操作者、不同仪器、不同试剂批次、多日内）使用3个血清样本分别进行重复检测统计评价，CV＜15%。

分析灵敏度（Analytical Sensitivity）

以下结果基于校准品的浓度值实验得出，未纳入基质效应等其他因素的潜在影响。

＊＊检出限LoD：0.55μmoL/L。

检测区间（Linearity）

＊＊检出限LoD：0.78-50μmoL/L。

分析特异性（Analytical specificity）

其他相关因子在稀释缓冲液中制备为10μg/mL测定，没有观察到明显的交叉反应。 

注意事项

• 试剂盒内所有成分仅供研究使用！

• 终止液含稀硫酸，具有腐蚀性，应谨慎操作。

• 试剂盒成分含防腐剂、蛋白成分等，可能引起皮肤过敏反应，应佩带口罩避免吸入薄雾。

• 显色剂、浓缩洗液可能引起皮肤、眼睛和呼吸道刺激，应佩带口罩避免吸入薄雾。

• 佩戴防护手套、防护服、眼睛和面部防护用品，实验操作后＊＊洗手。

技术要点

• 不同批次的试剂盒不能混用，不建议将不同板上的微孔板条组装在一块板上检测，尽管是同一批次试剂，也可能存在板与板之间的差异。

• 每次实验时应当始终配制标准曲线平行检测，不能将上一次的标准曲线用于下一次实验结果的计算。

• 不要使用超过有效期的试剂盒进行检测。

• 底物显色剂应当为无色，如变蓝表明已变质，不能应用于实验。

• 使用适当的封板膜密封微孔板条，以便检测结果更加可靠。

• 操作时尽量避免产生气泡。不要将不同试剂瓶的瓶盖交叉使用。

• 应当遵循说明书的操作进行实验，不按照说明书的操作将导致实验结果的变化，任何不遵循说明书的实验操作应当事先询问售后技术支持的建议。否则我们不保证实验结果的可靠。