肉毒碱棕榈酰转移酶（CPT-1）试剂盒

肉毒碱棕榈酰转移酶（CPT-1）试剂盒

分光光度法 

50 管/48 样 

货号：DM-C-CPT1 

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定 

测定意义： 肉毒碱棕榈酰转移酶是存在于线粒体内膜的一类酰基转移酶。可逆地催化从酰基辅酶 A 将酰 基转移至 L-肉毒碱的反应，在转运脂肪酸通过线粒体内膜的过程中起重要作用。 测定原理： 基于肉碱和脂酰辅酶 A 在丙二酰辅酶 A 存在与否的条件下，通过肉碱脂酰转移酶(CPT-I)的 作用，产生脂酰肉碱，并释放出巯基辅酶 A(COA-SH)，与 Ellman 试剂 DN-TB 反应后，产 生黄色的 TNB。通过其吸收峰值得变化（412nm），来定量分析 CPT-1 的活性。 

需自备的仪器和用品： 可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL 玻璃比色皿、研钵、冰、无 水乙醇和蒸馏水 

试剂组成和配制： 试剂一：液体 50mL×1 瓶，-20℃保存； 试剂二：液体 10mL×1 瓶，-20℃保存； 试剂三：液体 1mL×1 支，-20℃保存； 试剂四：液体 55mL×1 瓶，4℃保存； 试剂五：粉剂×1 瓶，4℃保存； 试剂六：粉剂×1 支，-20℃保存； 

样本的前处理： 组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离： ① 称取约 0.1g 组织或收集 500 万细胞，加入 1mL 试剂一和 10uL 试剂三，用冰浴匀浆器 或研钵匀浆。 ② 将匀浆液于 600g，4℃离心 5min。 ③ 弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心 10min。 ④ 上清液即胞浆提取物，可用于测定从线粒体泄漏的 CPT-1（此步可选做）。 ⑤ 在步骤④的沉淀中加入 200uL 试剂二和 2uL 试剂三，超声波破碎（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3 秒，间隔 10 秒，重复 30 次），用于线粒体 CPT-1 测定。 

测定步骤： 1、分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 412nm，蒸馏水调零。 2、样本测定 （1） 在试剂五中加入 2mL 无水乙醇，混匀，再加入 44mL 试剂四，混匀，37℃（哺乳动物） 或 25℃（其它物种）孵育 5min；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融； （2） 在试剂六中加入 2mL 蒸馏水，混匀，37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）孵育 5min； 用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融； 上海笃玛生物科技有限公司 www.dumabio.com（3） 在 1mL 玻璃比色皿中加入 40μL 样本、880μL 试剂五和 40μL 试剂六，混匀，记录 412nm 处 20 秒时的初始吸光度 A1 和 2 分 20 秒时的吸光度 A2，计算 ΔA=A2-A1。 CPT-1 

活性计算： （1） 按样本蛋白浓度计算： 单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟催化产生 1 nmol TNB 定义为一个酶活力单位。 CPT-1（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10 9]÷(V 样×Cpr) ÷T=880×ΔA÷Cpr 此法需要自行测定样本蛋白质浓度。 （2） 按样本鲜重计算： 单位的定义：每 g 组织每分钟催化产生 1 nmol TNB 定义为一个酶活力单位。 CPT-1（nmol/min/g 鲜重）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10 9]÷（W× V 样÷V 样总）÷T=177.8×ΔA÷W （3） 按细菌或细胞密度计算： 单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟催化产生 1 nmol TNB 定义为一个酶活力单位。 CPT-1（nmol/min/10 4 cell）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10 9]÷（500×V 样÷V 样总）÷T=0.3556×ΔA V 反总：反应体系总体积，9.6×10 -4 L；ε：TNB 摩尔消光系数，1.36×10 4 L / mol /cm；d：比 色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.04 mL；V 样总：加入提取液体积，0.202 mL；T： 反应时间，2 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细胞或细菌总 数，500 万。 上海笃玛生物科技有限公司 www.dumabio.com