全蛋白提取试剂盒

全蛋白提取试剂盒

产品简介：

 全蛋白提取试剂盒由蛋白提取试剂、磷酸酶抑制剂、蛋白酶抑制剂和 PMSF 组成， 用于对哺乳动物组织和培养细胞进行匀浆裂解， 从中提取全蛋白。本产品作用温和， 提取过程简便高效，获得的全蛋白可用于 Western Blot、免疫共沉淀等后续研究， 但不能用于蛋白激酶及磷酸酶免疫共沉淀的研究， 因本试剂盒中包括这两种酶的抑制剂。该试剂仅  用于科研领域， 不适用于临床诊断或其他用途。

产品组成：

操作步骤(仅供参考)：

1、配制预冷的全蛋白提取工作液：

在每 1ml 蛋白提取试剂中加入 10μl 磷酸酶抑制剂(100×)， 10μl 蛋白酶抑制剂(100 ×)和 10μl PMSF 溶液(100mM)， 混匀， 冰上保存待用。

2、组织蛋白提取：

(1)每 100mg 固体组织置于培养皿中， 手术剪剪碎成 3mm×3mm 左右的小块，加入 0.5 ~ 1ml 预冷的全蛋白提取工作液， 玻璃匀浆器上下手动匀浆 30-50 次， 注意低温操作；

(2)取组织匀浆液转移到 1.5ml 预冷的离心管， 12000g 4℃  离心 5min；

(3)取上清转移至新的预冷的离心管中， 即为全蛋白提取物， 蛋白定量 （Bradford 法、 BCA 法） ；

(4)分装保存于-70℃ ,  避免反复冻融。

3、培养细胞蛋白提取：

(1)贴壁培养的细胞， 吸去培养基后， 加入 10ml/150mm 培养板的冷 PBS 洗两次， 每次振 摇数次以尽量去除培养液；

(2)悬浮培养的细胞或用细胞刮子刮下的贴壁细胞，将细胞及培养液移至离心管中， 500g 离

8、一般常规提取的蛋白样品， 进行后续试验不需要透析， 但如果需要较大量的提取蛋白或 后续试验结果不理想， 则需要将提取的蛋白样品进行透析脱盐。

9、对于提取的蛋白质可以采用 BCA 蛋白定量试剂盒(PT0001)、Bradford 蛋白定量试剂盒 (PT0002)或微量 BCA 蛋白定量试剂盒(PT0006)对提取样品中的蛋白质进行定量。

10、对胶上的蛋白质进行染色， 可以采用常规考马斯亮蓝染色试剂盒(PT0020)或考马斯亮 蓝快速染色液(免脱色)(PT0015)来染色。

11、裂解产物中经常会出现一小团透明胶状物， 属正常现象， 该透明胶状物为含有基因组DNA 等复合物， 在不检测和基因组 DNA 结合特别紧密的蛋白的情况下可以直接离心取 上清用于后续实验； 如果需要检测和基因组结合特别紧密的蛋白， 则可以通过超声处理  打碎打散该透明胶状物， 随后离心取上清用于后续实验。

12、使用后请旋紧瓶盖， 防止溶液挥发和与空气中的物质发生化学反应。

13、试剂开封后请尽快使用， 以防影响后续实验效果。

14、为了您的安全和健康， 请穿实验服并戴一次性手套操作。

有效期： 12 个月有效； 低温运输， 按要求保存。

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(3)细胞洗涤后， 转至新的预冷的离心管中， 加入预冷的全蛋白提取工作液， 加入量如下表

所示：

(4)置于 4℃摇床平台上， 剧烈振荡 30s， 放置冰上 4 分钟， 重复 5 次；

(5) 12000g 4℃离心  5min， 取上清为全蛋白提取物， 蛋白定量 （Bradford 法、BCA 法）；

(6)分装保存于-70℃ ,  避免反复冻融。

注意事项：

1、所有的试剂及器具均需预冷后使用， 以保持蛋白质的完整性和活性。细胞裂解的操作应 置于冰上或 4℃进行。

2、蛋白提取试剂含有  特殊成分， 在低温情况下可能出现浑浊现象， 可 37℃水浴 促其溶解， 不影响使用效果； 溶解时间不易过长， 避免成分失效， 4 度保存即可， 长期  不用亦可-20℃保存。

3、 PMSF 溶液可置 4℃保存 1~2 周， -20℃可保存 1 年以上， 室温放置 2 天即可能失效。 另外， PSMF(有毒)需现用现加， 因为 PMSF 在水溶液中会快速降解。

4、如果细胞量较多， 必需分装成 50～ 100 万细胞/离心管， 然后再裂解， 大团的细胞较难 裂解充分， 而少量的细胞由于裂解液容易和细胞充分接触， 相对比较容易裂解充分。

5、如果组织样品本身非常细小， 可以适当剪切后直接加入裂解液裂解， 通过强烈 Vortex  使样品裂解充分， 然后同样离心取上清用于后续实验， 直接裂解的优点是比较方便， 不 必使用匀浆器， 缺点是不如使用匀浆器裂解的充分。

6、如果裂解不充分可以适当增加裂解液的用量， 如果需要高浓度的蛋白样品， 可以适当减 少裂解液的用量或增加样品量。

7、 除振荡裂解外， 亦可采用超声破碎法， 每次 30s， 间隔 1min， 连续超声 3~4 次， 置于 冰上冷却。超声破碎细胞后应镜检， 细胞破碎率不小于 90％。