小鼠CD4+CD25+Treg细胞分选试剂盒-100T(柱式，组合)

产品概述

分选策略采用两步柱式组合的方式，先通过阴性预富集得到 CD4⁺T 细胞，再进行阳性筛选获取 CD25⁺Treg 细胞。首先利用阴性去除体系去掉 B 细胞、CD8⁺T 细胞、巨噬细胞、NK 细胞等杂细胞，获得富集后的 CD4⁺T 细胞组分，再对富集产物进行 CD25⁺的阳性磁珠标记，经过磁性分选柱捕获 CD4⁺CD25⁺ Treg，最后洗脱收集目的细胞。
两步组合的优势在于，如果直接对脾脏总细胞进行 CD25 阳性分选，产物当中会混入已经活化的普通 CD4⁺CD25⁺效应 T 细胞；先做 CD4⁺的预富集可以明显降低杂细胞污染，最终提升 Foxp3 阳性细胞所占的比例。

基础产品参数

产品规格为 100 次反应，适配磁性分选柱体系，兼容 LD、MS 柱以及 MACS 类型的磁分离器。推荐样本材料为小鼠脾脏或者淋巴结制备得到的单细胞悬液，不建议直接处理全血，优先制备脾淋巴细胞再开展分选。单次反应的起始总脾细胞数量建议不要超过 1×10⁸个。使用 6‑8 周 C57BL/6 小鼠脾脏样本，在规范操作条件下，分选后 CD4⁺CD25⁺细胞纯度可以达到 88‑92%，分选得到的 Treg 细胞当中 Foxp3 阳性占比约 75‑85%，细胞活性能维持在 85% 以上。整套分选操作从样本标记到收集细胞耗时大概 90‑120 分钟。试剂盒储存条件为 2‑8℃冷藏，严禁冷冻保存。下游可以用于 Treg 体外抑制共培养、核酸提取 qPCR、流式检测以及体外细胞扩增。需要留意分选后磁珠仍然保留在细胞表面，一般不干扰后续 Foxp3 胞内染色；如果后续实验需要去除细胞表面磁珠，则需要选用可解离释放型磁珠的试剂盒版本。

试剂盒组分（100T 套装）

试剂盒包含阴性去除抗体鸡尾酒，为生物素标记的杂细胞混合抗体，用于 CD4⁺T 细胞的预富集；配套小鼠 CD25‑Biotin 阳性标记抗体；链霉亲和素偶联纳米磁珠用于磁性标记；还有分选缓冲液浓缩液，使用前需要采用不含钙镁的无菌 PBS 添加 0.5‑1% BSA 进行稀释。注意本套试剂盒并不包含磁性分选柱与磁分离器，柱体和磁场支架需要用户另行采购。

简要操作流程

首先制备小鼠脾脏单细胞悬液，裂解红细胞之后过筛除去细胞团块，完成细胞计数。di一步开展阴性分选，加入阴性抗体鸡尾酒置于冰上孵育，之后补加链霉亲和素磁珠，细胞悬液上样至 LD 阴性分选柱，收集流出的流穿液，这一部分就是预富集后的 CD4⁺T 细胞。收集流穿下来的细胞组分之后重新计数，加入 CD25 生物素标记抗体进行孵育，再补充磁珠完成 CD25⁺细胞的标记。随后进入第二步阳性分选，将标记好的细胞悬液上样至 MS 阳性分选柱，洗柱洗除 CD4⁺CD25⁻的普通 T 细胞，之后把分选柱移出磁场，洗脱滞留在柱基质上的细胞，所得即为 CD4⁺CD25⁺ Treg。收集细胞之后低速离心重悬，优先通过流式细胞术验证细胞纯度，再开展后续实验。

关键注意事项

全程分选缓冲液必须选用不含钙离子、镁离子的 PBS‑BSA 缓冲体系，钙离子会诱导细胞发生粘附团聚，直接造成分选回收率明显下降。所有抗体孵育步骤都在冰上完成，环境温度升高会加重抗体非特异性结合，直接降低最终细胞纯度。小鼠脾脏当中天然 Treg 本身占淋巴细胞比例偏低，大致在 5‑8% 区间，单次实验起始细胞总量不宜过低，否则最终细胞回收率会不理想。这套试剂盒分选只依靠 CD4 以及 CD25 两个表面标记，CD25 同样会表达于活化状态的普通 CD4 效应 T 细胞，因此该方法没有办法从表面标记层面完全区分天然 Treg 和活化 T 细胞，后续实验务必要结合 Foxp3 胞内染色完成细胞的鉴定验证。分选所用全部缓冲液尽量保证无菌，分选得到的 Treg 细胞比较脆弱，应当尽量减少离心操作，离心参数设置为 300‑350 g，离心 5‑6 分钟。优先使用新鲜解离的单细胞悬液完成分选，不建议采用冻存复苏之后的脾脏淋巴细胞，冻存复苏处理之后 Treg 的细胞活性以及最终回收率都会出现明显下滑。