ELISA间接竞争法原理+步骤+注意事项

ELISA竞争法不只有一种。上一期我们讲了直接竞争法，这一期来讲讲间接竞争法。夹心法适合大分子，竞争法适合小分子。而竞争法内部又分两种——直接竞争法和间接竞争法。上次我们聊了直接竞争法，这一次来看间接竞争法。

间接竞争法原理
间接竞争法的核心逻辑是：样本中的目标抗原和板底包被的抗原，一起竞争溶液中有限的检测抗体。板底预先包被了已知浓度的目标抗原。加入样本的同时，也加入酶标抗体。如果样本中目标抗原浓度高，就会占掉更多的抗体，板底包被抗原能结合到的抗体就少，最终信号就弱。如果样本中目标抗原浓度低，抗体就能更多地结合到板底包被抗原上，信号就强。一句话：信号越弱，浓度越高——信号强度与目标物浓度成反比。

四步操作流程
di一步：包被抗原——微孔板预先包被目标抗原。
第二步：加入样本与酶标抗体，孵育——向孔中同时加入待测样本和酶标抗体，让两者在同一条起跑线上竞争结合抗体。封板后孵育，让抗原与抗体充分结合。
第三步：洗板——彻di洗涤，去除未结合的物质。洗涤不彻di会导致背景升高。
第四步：加底物显色，读数——加TMB底物避光显色，加终止液终止反应，立即用酶标仪在450nm或双波长下读取OD值。

注意事项
1.包被抗原和酶标抗体必须高纯度、高活性，两者都不能反复冻融，否则灵敏度会明显下降。
2.样本和酶标抗体必须同时加入孔中，不能在时间上有先后。同时建议用振荡器辅助孵育，让抗原和抗体充分接触。
3.信号与浓度成反比——浓度越高，OD值越低。加样顺序和孵育时间以试剂盒说明书为准。

一句话总结
ELISA间接竞争法，就是让样本中的目标抗原和板底包被的抗原“抢”同一个抗体——抢到的抗原越多，信号越弱；抢到的越少，信号越强。和直接竞争法的区别在于：直接竞争法包被的是抗体，间接竞争法包被的是抗原。