以下是影响ELISA检测的关键要素，也是很多ELISA 用户在试验中常常遇到的问题及处理方案 ：

　　Q1：为什么一切试剂和检测样本要平衡至室温后再进行加样操作？

　　A1：温度是ELISA结合反响的重要影响要素。为了使一切样本在一致的温度下反响，试验前务 必将一切试剂平衡至室温，包括检测样本。避免因温度的动力学反响差异而导致ELISA检测结 果的不精确。

　　Q2：为什么规范曲线线性较差？

　　A2：依照引荐方法保存规范品；溶解规范品之前需时刻短离心，彻底搜集粉末；确保规范品彻底 溶解和混匀（大约10min），然后再进行后续的系列稀释进程，确保每一步都充沛混匀且精确 移液；显色的恰当停止；挑选适宜的数学拟合方程制作规范曲线。

　　Q3：ELISA试验为什么有必要设置复孔？

　　A3：为取得更精确的试验成果，强烈建议规范品及样本进行复孔检测。 由于复孔检测能够：

　　★核算平均值，确保试验成果更精确；

　　★处理试验中误操作形成的跳孔现象；

　　★核算CV值，对试验的操作和试剂盒的精密度进行评价。

　　Q4：为什么试验进程中孵育、洗刷需求振动？怎么振动？

　　A4：振动孵育使反响更充沛，振动洗刷使布景更洁净。建议运用酶标专用96孔微孔板振动器。 孵育进程振动，能够加速、加强抗原抗体间的彼此磕碰触摸，使得反响进程愈加彻底，OD值通 常会比未振动孵育的成果要高；洗刷进程振动，能够使洗板更洁净，在很大程度上能下降布景 值，同时能够进步试剂盒检测的灵敏度。

　　Q5：何时停止ELISA反响？

　　A5：ELISA试验zui终需求酶催化底物显色反响来完结，在zui适宜的时刻停止反响是ELISA试验成 功的重要要素。在HRP-TMB酶反响体系中，当zui高浓度规范品色彩不再变深，倒数2-3个浓度标 准品色彩开端有浅蓝色时，便需求停止反响；或许也能够根据zui高浓度规范品孔在620nm的OD 值来决议，OD620=0.9-0.95之间时即可停止。

　　Q6：为什么酶标仪读数时有必要选用双波长？

　　A6：首要，酶标仪运用前必须预热10-15min，使测读成果更安稳。其次，ELISA试验采用双波 长测定吸光度，能够扫除单波长检测时的测定搅扰（标本的浓度，搅扰色等）。一般采用zui大 波长作为参照波长，在参照波长下，检测物的吸光值zui小，检测波长和参照波长的吸光值之差 能够消除非特异性吸收；因而，双波长测定，可zui大极限的消除指纹、杂质及不透光的物质对 酶标仪读数带来的差错，以确保试验数据的精确度。